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Biblioteca(s): 	Embrapa Agrobiologia.	
Data corrente: 	23/06/2008	
Data da última atualização: 	17/11/2015	
Autoria: 	RODRIGUES, E. P.	
Título: 	Isolamento e caracterização de mutantes de Gluconacetobacter diazotrophicus defectivos na produção de auxinas.	
Ano de publicação: 	2008	
Fonte/Imprenta: 	2008. 142 p. Tese (Doutorado) - Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Vegetal, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ.	
Idioma: 	Português	
Notas: 	Orientador: José Ivo Baldani;
Co-orientadores: Márcia Soares Vidal; Jean Luiz Simões Araújo.	
Conteúdo: 	A espécie Gluconacetobacter diazotrophicus é uma bactéria endofítica de cana-de-açúcar conhecida por beneficiar o crescimento e o acúmulo de nitrogênio desta planta, devido principal mente a fixação biológica de nitrogênio (FBN); entretanto, recentemente a produção de auxinas (ácido-3-indol acético, AIA) tern sido considerada urn fator importante na promoção do crescimento da cana-de-açúcar por G. diazotrophicus. Devido a importância deste fitormônio, 0 presente trabalho teve como objetivo estudar as vias de biossíntese e os genes envolvidos na produção de auxinas em G. diazotrophicus. As possíveis vias de biossíntese de auxinas no genoma de G. diazotrophicus foram identificadas por meio de análises de similaridade, utilizando ferramentas de bioinformática. Em adição, mutantes aleatórios foram gerados pela inserção do Tn5 no DNA da estirpe selvagem PAL5T e avaliados quanto a produção de auxinas utilizando o reagente de Salkowski. Os mutantes que apresentaram alteração significativa na produção de auxinas foram selecionados e caracterizados por técnicas moleculares (Southern-blot, PCR invertido e sequenciamento) e por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC). As análises in silica possibilitaram identificar no genoma de G. diazotrophicus fases de leitura aberta (ORFs) que podem estar envolvidas em três rotas de biossíntese de AlA: via indol-3-ácido pirl1vico, via triptamina e via indol-3-acetonitrila. Os experimentos de seleção com o reagente de Salkowski permitiram isolar sete mutantes defectivos para a produção de auxinas: GdiaaOl, Gdiaa02, Gdiaa09, Gdiaa24, Gdiaa31, Gdiaa34, Gdiaa84. A caracterização molecular destes mutantes permitiu determinar que em dois mutantes (Gdiaa34 e GdiaaO I) 0 Tn5 foi inserido em sítios diferentes de uma mesma ORF (GDI2456), que codifica uma L-aminoácido oxidase contendo flavina (EC 1.4.3.2). Nos mutantes Gdiaa24 e Gdiaa31 o Tn5 foi inserido na região regulatória de urn grupo gênico formado pelas ORFs tonB, exbB, exbDJ, exbD2 e uma proteína hipotética (GDI 1387). Esta última foi identificada como o local de inserção do Tn5 no mutante Gdiaa02. No mutante Gdiaa09 0 Tn5 foi inserido na ORF GD12045 e no mutante Gdiaa84 na ORF GDII489, que codificam protein as hipotéticas. As analises por HPLC permitiram identificar e quantificar os compostos acido-3-indol piruvico (IPyA), indol-3-ácido latico (ILA) e indol-3-dcido acetico (AlA) no sobrenadante da estirpe selvagem. Nos mutantes GdiaaOl, Gdiaa31 e Gdiaa34, os compostos IPyA e ILA foram identificados, entretanto, a quantidade observada foi apenas 5% da quantidade produzida pela estirpe selvagem. Por outro lado, nos mutantes Gdiaa02, Gdiaa09, Gdiaa24 e Gdiaa84 0 perfil cromatognifico foi semelhante ao da estirpe selvagem, sendo identificados os compostos IPyA, lLA e AIA em quantidade similar ao encontrado no sobrenadante da estirpe selvagem. Embora com as analises in silico seja possivel indicar a existência de tres frotas de biossíntese de AlA em G. diazotrophicus, os resultados obtidos com a caracterização dos mutantes, mostraram que a principal rota de biossíntese de AlA em G. diazotrophicus e a via do IPyA; sendo a primeira etapa desta via (triptofano-IPyA) catalisada par uma L-aminoácido oxidase codificada pela ORF GD12456. Em adição, foi possível observar que a produção de auxinas foi afetada pela inserção do Tn5 na região regulatória do grupo gênico tonB-exBDJ D2, os quais codificam protein as de membrana (TonB-ExbBD) envolvidas no transporte ativo de moléculas em bactérias gram-negativas. lsto sugere, portanto, que estas ORFs podem estar envolvidas no transporte de auxinas produzidas por G. diazotrophicus.
Gluconacetobacter diazotrophicus is endophytic bacteria of sugarcane know by your benefit on growth and nitrogen accumulation in this plant, attributed principally to biological nitrogen fixation (BNF); however, recently auxin (indole-3-acetic acid, IAA) production have been considered an importantly factor on growth promotion of sugarcane by G. diazotrophicus. This form, the present work had as objective to study the pathways and genes involved in auxin production by G. diazotrophicus. The putative pathways of auxins biosynthesis on G. diazotrophicus genome were identified by similarity with bioinformatics tools. Additionally, random mutants were obtaiged by TnS insertion in DNA of type strain PALST. Approximately 5.700 mutants were evaluated with Salkowski reagent for auxin production. Mutants that showed significantly alteration on auxin production were selected and characterized with molecular techniques (southern-blot, inverse PCR e sequencing) and by high-pressure liquid chromatography (HPLC). In silico analysis possibility to identify on genome open ready frames (ORFs) that may to be involved in 3 pathways of IAA biosynthesis: via indole-3-pyruvic acid, via tryptamine and via indole-3-acetonitrile. The selection experiments with Salkowski reagent possibility to isolate seven defectives mutants for auxin production: GdiaaO I, Gdiaa02, Gdiaa09, Gdiaa24, Gdiaa31, Gdiaa34 and Gdiaa84. The molecular characterization theses mutant showed that in Gdiaa34 e GdiaaO I the Tn5 insertion occurred in different sites of an ORF (GDI2456). This ORF codify an L-amino acid oxidase flavin containing (EC 1.4.3.2). In Gdiaa24 e Gdiaa31, the TnS insertion was in regulatory region of gene cluster tonB, exbB, exbDl. exbD2 and hypothetic protein (GDI1387). This latter was identify as insertion site of Tn5 in Gdiaa02. In Gdiaa09, the insertion site occurred on ORF GDI2045 and in Gdiaa84 in the ORF GDI1489, which codify hypothetic proteins. With HPLC analysis were showed the presence of the indoles compost indole-3-pyruvic acid (IPyA) , indole-3-lactic acid (ILA) and indole-3-acetic acid (IAA) in the PALST supernatant. In GdiaaO I, Gdiaa31 and Gdiaa34, the indoles IPy A and ILA were observed in reduced amount that correspond to only 5% of amount observed in PAL5T. By the way, the chromatography feature and amount of indoles IPyA, ILA e IAA observed in the mutants Gdiaa02, Gdiaa09, Gdiaa24 and Gdiaa84 was similar to type strain. By in silico analysis, tree pathways may to suggest for auxin biosynthesis in G. diazotrophicus; however, the results obtained with mutants characterizations showed that auxin biosynthesis via IPyA is principal pathway in G. diazotrophicus. In addition, the early step this pathway (tryptophan -IPyA) is catalyzed by enzyme L-amino acid oxidase which is codified by ORF GDI24S6. Also, was possible to observe that auxin production was changed by TnS insertion on regulatory region do cluster tonB-exBDID2. These OR.Fs codify membrane proteiIi~ (TonB-ExbBD) involved in active transport of molecules on gram-negative bacteria. This suggests that this cluster may to be involved in auxin transport in G. diazotrophicus.	
Palavras-Chave: 	Bactéria endofítica; Biotecnologia de microrganismo relacionados a plantas; Cana-de-açúcar; FBN; Fixação biológica de nitrogênio; Mutagênese; Regulador de crescimento das plantas.	
Thesagro: 	Biossíntese; Isolamento; Purificação.	
Thesaurus Nal: 	Gluconacetobacter diazotrophicus.	
Categoria do assunto: 	--	
Registro original: 	Embrapa Agrobiologia (CNPAB)	
Exemplares: 	CNPAB - (35187-1) - UPA - TS - -- - 2008.00008 -  - 2008.00008 - DIS